- 影響因素
從酶活定義中我們可以看出，影響酶活性實(shí)驗(yàn)的主要因素有溫度、pH、時(shí)間。
學(xué)過(guò)酶工程的小伙伴應(yīng)該很清楚，酶活性實(shí)驗(yàn)的本質(zhì)還是酶促反應(yīng)嘛，所有影響酶促反應(yīng)的因素都同樣影響酶活性實(shí)驗(yàn)。
1、溫度：一般來(lái)說(shuō)，在一定溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快，但當(dāng)溫度增加達(dá)到某一點(diǎn)后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降。酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達(dá)到一最大值時(shí)的溫度就稱(chēng)為酶的最適溫度。
所以，我們?cè)谧雒富钚詫?shí)驗(yàn)的時(shí)候，一定要嚴(yán)格的控制反應(yīng)溫度，保證同一批樣品都在相同的溫度下進(jìn)行，可以選擇水浴或金屬浴保溫。溫度最好選擇在最適溫度，如果無(wú)法判斷最適溫度，那就遵循哺乳動(dòng)物樣本37℃，其他樣本25℃的原則。當(dāng)然，對(duì)于一些反應(yīng)時(shí)間很短的酶活實(shí)驗(yàn)，很難嚴(yán)格控溫，可以在室溫下反應(yīng)（室溫在20-40℃），保證一批樣品測(cè)定過(guò)程中室溫穩(wěn)定一致。
2、pH：pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，通常為一鐘形曲線(xiàn)，即pH過(guò)高或過(guò)低均可導(dǎo)致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時(shí)溶液的pH值就稱(chēng)為酶的最適pH。
酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中通常會(huì)選擇在最適pH下進(jìn)行，pH由緩沖液或底物提供，如pH6.8的PBS緩沖液、pH7.4的生理鹽水、pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液等。一般參考指導(dǎo)書(shū)或試劑盒說(shuō)明書(shū)即可。如果無(wú)法確定最適pH，那就用7.0-7.4吧，適合大部分酶。
3、時(shí)間：時(shí)間對(duì)酶促反應(yīng)的影響主要體現(xiàn)在反應(yīng)速率的變化和反應(yīng)階段的劃分上。酶促反應(yīng)過(guò)程中，時(shí)間會(huì)影響反應(yīng)的速率和進(jìn)程，主要分為延滯期、線(xiàn)性期和非線(xiàn)性期三個(gè)階段。在延滯期，酶與底物結(jié)合需要一定的時(shí)間，反應(yīng)速率較慢。在線(xiàn)性期，酶促反應(yīng)速度達(dá)到并保持恒定速率進(jìn)行反應(yīng)。此時(shí)，反應(yīng)速率不受底物濃度的影響，酶活性與反應(yīng)速率成正比，是酶活性測(cè)定的最佳時(shí)期。這段時(shí)間一般為1到5分鐘（可能更長(zhǎng)）。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底物消耗越來(lái)越明顯，反應(yīng)速率逐漸下降，進(jìn)入非線(xiàn)性期。
線(xiàn)性期是酶活性測(cè)定的最佳時(shí)期。如葉片的POD酶活性檢測(cè)，通常選擇30s-2min30s作為最佳測(cè)定時(shí)間。不同酶的線(xiàn)性期也不同，一般參考指導(dǎo)書(shū)或試劑盒說(shuō)明書(shū)。
4、酶液濃度和酶液用量：在底物濃度足夠大，足以使酶飽和的情況下，酶促反應(yīng)的速度與酶濃度成正比。
酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，如果遇到OD值變化很小的情況，可以適當(dāng)增加酶液用量（體積）或增大酶液濃度（重新提取酶液，減少提取液用量）。
在酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，除了上述4個(gè)影響因素外，還有底物濃度、金屬離子等也能影響酶促反應(yīng)。這些在指導(dǎo)書(shū)或試劑盒中已經(jīng)準(zhǔn)備好了，不做過(guò)多說(shuō)明。
值得注意的是：同一批樣品一定要保證所用試劑的pH、底物濃度、金屬離子等一致，如果一批樣品檢測(cè)要用多個(gè)同貨號(hào)的試劑盒，要將相同組分提前混勻，以消除試劑盒配置的批次誤差。如果是自配試劑也一樣操作。
